A játék a múltban játszódó történetében főszereplőnk a fiatal Ezio Auditore da Firenze, kinek családját elárulják ezokból válik assassinná és a történet további részében a bosszú vágy vezérli.
Ezio elvitte megrettent húgát és megnémult anyját a vidéki villába, melyet nagybátyja, Mario Auditore vezetett, hogy védelmet nyújtson neki. Itt kezdődött meg Ezio Asszaszinná való kiképzése. Ezenfelül Mario megosztotta vele az információit és listáját azokról az emberekről, akiknek része volt a család meggyilkolásában. A szálak Firenzéből San Ginamonnba, majd Forlíba, Velencébe és végül magába a Vatikánba vezettek.
